ELISA方法現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。拋開(kāi)試劑盒本身質(zhì)量外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也有很多因素都會(huì)影響試驗(yàn)的正常結(jié)果。其中最常出現(xiàn)的問(wèn)題是顯色淡，靈敏度偏低、重復(fù)性不佳、假陽(yáng)性結(jié)果和假陰性結(jié)果，不管出現(xiàn)什么樣的結(jié)果都會(huì)直接影響我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面來(lái)分析ELISA實(shí)驗(yàn)非正常檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的常見(jiàn)原因，并分析其解決辦法，以提高檢測(cè)質(zhì)量。
1、方法學(xué)的影響
ELISA 測(cè)定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法, 其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法因受操作時(shí)差所引起的競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響, 結(jié)果重復(fù)性較差, 質(zhì)量較難控制。
2、試劑因素
試劑的選擇 檢測(cè)的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過(guò)程受多種因素的影響, 如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等, 因而檢測(cè)結(jié)果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號(hào)間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測(cè)的水平, 因此在引入新項(xiàng)目之前必須對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)步驟: (1) 確定開(kāi)展該項(xiàng)目的必要性; (2) 了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢測(cè)方法和原理; (3) 在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較,判斷標(biāo)準(zhǔn)參考方法或參考物質(zhì), 其次為臨床的滿意度及機(jī)構(gòu)的報(bào)告如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、CDC 報(bào)告等; (4) 定期對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。
3、樣本因素
標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素,前者包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體等, 后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們?cè)跈z測(cè)過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見(jiàn)的疑難病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對(duì)外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明:
標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán), 其具有類過(guò)氧化物的活性, 因此, 在以辣根過(guò)氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標(biāo)記酶的ELISA 測(cè)定中, 如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相, 從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。
ELISA 操作步驟復(fù)雜, 操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或者推動(dòng)桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn), 尤其是對(duì)于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室, 因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時(shí)均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快, 避免將標(biāo)本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響, 操作時(shí)差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測(cè)標(biāo)本多達(dá)幾百個(gè),從加入第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著前后時(shí)間差異, 使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致, 操作時(shí)差對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的結(jié)果影響更大, 在加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道。
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